Равилов Р.Х., Кострова А.В., Вафин Р.Р.
ФГОУ ВПО “Казанская государственная академия
ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана”
Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа.
Исходя из этого, ведущим направлением в исследовании хламидиоза является молекулярно-биологические методы индикации и идентификации хламидий – ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), секвенирование ДНК и другие. Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью и возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия хламидий. Эти методы позволяют проводить индикацию и идентификацию патогенных агентов на основе регистрации и анализа ДНК.
Хламидиоз среди птиц имеет широкое распространение (не менее 132 видов), особенно у попугаев, голубей, уток, индюков и гусей. Птицы являются резервуаром Chl. psittaci в природе, среди которых насчитывается. Исследователи неоднократно указывают на декоративных птиц как на потенциальный источник хламидий. Владельцы декоративных птиц не всегда информированы о возможности заражения хламидийными инфекциями от своих питомцев.
Целью данной работы являлись молекулярно-генетические исследования попугая,
Материалом для исследования служил клинический материал от попугая, которому был поставлен диагноз на хламидиоз методом люминисцентной микроскопии (РИФ) и серологическими тестами (РСК). При подготовке проб патологического материала для ПЦР 100 мкл суспензии на дистиллированной воде кипятили в течение 10 минут в герметичных пробирках Eppendorf, центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость использовали для постановки ПЦР.
ПЦР проводили с использованием специфичных для Chl. psittaci олигонуклеотидных праймеров, предложенных R.G.Hewinson et al. (1997).
“CPF”: 5’-GCAAGACACTCCTCAAAGCC-3’;
“CPR”: 5’-CCTTCCCACATAGTGCCATC-3’.
Разработанный ПЦР-тест основан на амплификации фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов, который включает в себя 5’-нетранслируемый регион и часть гена Chl. psittaci, кодирующего синтез большого белка наружной мембраны возбудителя.
Продукты амплификации вносили в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04М трис-ацетат, 0,002М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подтвергали горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 10В/см в течение 1,5-2 часов с последующим просматриванием фореграмм в УФ-трансиллюминаторе (290-330нм) и фотографированием, используя оранжевый светофильтр. Образовавшиеся продукты амплификации идентифицировали относительно положительного контроля или используя ДНК-маркеры.
Результатом ПЦР патологического материала со специфичными праймерами “CPF” и “CPR” явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов (рис. 1).
Электрофореграмма результатов ПЦР (с праймерами 5СPF и 3СPR) участка omp1-гена ДНК хламидий.
Обозначения:
M ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим)
1 Положительный контроль (штамм Ростиново-70)
2 Исследуемая проба
3 Отрицательный контроль (dH2O)
Таким образом, проведенные исследования подтвердили возможность индикации возбудителей хламидиоза в клиническом материале, полученном от попугаев с использованием искусственно синтезированных олигонуклеотидных праймеров “CPF” и “CPR”.
УДК 619:616.9:636.9