Круглосуточный телефон справочной ветеринарно-орнитологической службы

Москва. Госпиталь птиц +7(495)223-09-02, +7(926)608-43-46
МО г. Балашиха, Шоссе Энтузиастов д. 1, сзади ТЦ "Светофор"
Санкт-Петербург. Госпиталь птиц +7(921)771-60-31, +7(812)497-27-07
СПб, ВО, ул. Карташихина д. 12 с 11:00 до 20:00
Консультация орнитолога Москвы и СПб
+7(926)608-43-46



Балашиха - лечение собак, кошек, грызунов и рептилий
+7(495)521-84-50, 524-11-81

Отдел продаж и доставки на дома из питомника +7(925)072-65-10
Поиск




ИНДИКАЦИЯ ХЛАМИДИЙ У ПОПУГАЕВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ


Равилов Р.Х., Кострова А.В., Вафин Р.Р.
ФГОУ ВПО “Казанская государственная академия
ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана”

Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа.

Исходя из этого, ведущим направлением в исследовании хламидиоза является молекулярно-биологические методы индикации и идентификации хламидий – ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), секвенирование ДНК и другие. Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью и возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия хламидий. Эти методы позволяют проводить индикацию и идентификацию патогенных агентов на основе регистрации и анализа ДНК.

Хламидиоз среди птиц имеет широкое распространение (не менее 132 видов), особенно у попугаев, голубей, уток, индюков и гусей. Птицы являются резервуаром Chl. psittaci в природе, среди которых насчитывается. Исследователи неоднократно указывают на декоративных птиц как на потенциальный источник хламидий. Владельцы декоративных птиц не всегда информированы о возможности заражения хламидийными инфекциями от своих питомцев.

Целью данной работы являлись молекулярно-генетические исследования попугая,

Материалом для исследования служил клинический материал от попугая, которому был поставлен диагноз на хламидиоз методом люминисцентной микроскопии (РИФ) и серологическими тестами (РСК). При подготовке проб патологического материала для ПЦР 100 мкл суспензии на дистиллированной воде кипятили в течение 10 минут в герметичных пробирках Eppendorf, центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость использовали для постановки ПЦР.

ПЦР проводили с использованием специфичных для Chl. psittaci олигонуклеотидных праймеров, предложенных R.G.Hewinson et al. (1997).

“CPF”: 5’-GCAAGACACTCCTCAAAGCC-3’;

“CPR”: 5’-CCTTCCCACATAGTGCCATC-3’.

Разработанный ПЦР-тест основан на амплификации фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов, который включает в себя 5’-нетранслируемый регион и часть гена Chl. psittaci, кодирующего синтез большого белка наружной мембраны возбудителя.

Продукты амплификации вносили в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04М трис-ацетат, 0,002М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подтвергали горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 10В/см в течение 1,5-2 часов с последующим просматриванием фореграмм в УФ-трансиллюминаторе (290-330нм) и фотографированием, используя оранжевый светофильтр. Образовавшиеся продукты амплификации идентифицировали относительно положительного контроля или используя ДНК-маркеры.

Результатом ПЦР патологического материала со специфичными праймерами “CPF” и “CPR” явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов (рис. 1).

Электрофореграмма результатов ПЦР (с праймерами 5СPF и 3СPR) участка omp1-гена ДНК хламидий.

Обозначения:

M ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим)

1 Положительный контроль (штамм Ростиново-70)

2 Исследуемая проба

3 Отрицательный контроль (dH2O)

Таким образом, проведенные исследования подтвердили возможность индикации возбудителей хламидиоза в клиническом материале, полученном от попугаев с использованием искусственно синтезированных олигонуклеотидных праймеров “CPF” и “CPR”.

УДК 619:616.9:636.9




Форма связи



Похожие записи